La Electroforesis, es una técnica utilizada en los laboratorios de biología molecular, esta técnica permite separar las partículas según su movilidad usando campos eléctricos.
Está técnica permite:
a) Separar.
b) Purificar partículas o sustancias: ácidos nucleicos: ADN, ARN y proteínas en base a la composición de sus aminoácidos a un pH específico.
La electroforesis en conjunto con otras técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la hibridación, son fundamentales para el campo de ciencias biomédicas, debido a que permiten visualizar las bandas de los ácidos nucleicos (ARN o ADN) de diversos agentes patógenos, así como también permite detectar cambios o mutaciones que causan enfermedades genéticas en el individuo.
El cimiento de la electroforesis, radica en la migración de las moléculas a través de un gel u otra matriz porosa, que permiten la separación de acuerdo a su tamaño o peso molecular mediante la acción de un campo eléctrico.
La electroforesis permite visualizar, el progreso de la separación de las moléculas en la matriz y al mismo tiempo establecer un patrón de fragmentos, utilizando colorantes que tiñen las moléculas, y de esta forma proporcionar la visualización de las moléculas a manera de simples bandas, que luego serán analizadas e interpretadas
Variantes de la electroforesis,
a) La electroforesis puede ser de tipo vertical, se analizan tanto las moléculas de ADN como proteínas.
b) La electroforesis horizontal, generalmente se trabaja con ADN o ARN.
c) Existen otros métodos electroforéticos que presentan ciertas variaciones:
i. La electroforesis en campo pulsado, se visualizan fragmentos grandes de ADN (ADN genómico).
ii. La electroforesis bidimensional, se podría decir, que es un análisis más tecnológico y exhaustivo de las proteínas etc.
La electroforesis se fundamenta en dos propiedades importantes, la primera es la carga eléctrica de las moléculas, debido a que la mayoría de las moléculas están cargadas eléctricamente, al igual que ocurre en los electrolitos, las moléculas pueden ser ácidas o básica, dependiendo de su constante de ionización, y la segunda es la velocidad de las moléculas, debido a que la separación de las moléculas se realiza a través de un campo eléctrico, este campo eléctrico, tiene una fuerte intensidad, y la corriente eléctrica pasa constantemente del polo positivo al polo negativo, y en consecuencia, actuará una fuerza sobre la molécula y esta sufrirá una aceleración hasta obtener la velocidad necesaria que ofrezca la menor resistencia posible, probablemente por la densidad del medio en que se encuentra la molécula, y esta velocidad puede neutralizar la fuerza impulsora, permitiendo, que la molécula se desplace con una velocidad constante.
Tipos de electroforesis:
A. Electroforesis de frente móvil o libre, las moléculas que se quieren separar se pueden introducir en un tubo U, y estas sustancias pueden estar disueltas en buffer de pH y fuerza iónica adecuada. Posteriormente, se posicionan los electrodos en los brazos del dispositivo, provocando un campo eléctrico, por lo tanto, las moléculas proteicas cargadas emigran hacia los electrodos de la polaridad opuesta. Las proteínas migran a velocidades diferentes de acuerdo a sus cargas y tamaños.
B. Electroforesis de zona, Las moléculas se desplazan en soportes sólidos, estos soportes son: papel, celulosa o gel, y sólo es necesario una mínima cantidad de muestra que puede migrar en distintas bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, ocurre en una disolución estabilizada en un entorno que sirve de soporte.
Entre ellas tenemos:
• Electroforesis en papel,
i. la muestra se coloca en una cinta de papel de filtro previamente humedecida con un buffer (puede ser en el centro o en extremo de papel), dependiendo de las sustancias a separar y del pH del buffer. Los extremos de la cinta de papel se sumergen en dos recipientes separados que contienen el buffer y los electrodos, posteriormente se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se le emplea una diferencia de potencial durante un tiempo adecuado. De esta forma al aplicar una corriente directa, las moléculas cargadas de la mezcla pueden migrar hacia los electrodos de polaridad opuesta formando marcas (bandas) en el papel. La velocidad de migración de una molécula va a depender de su carga, y al terminar la corrida electroforética, se desconecta la fuente eléctrica y se secan las cinta de papel sobre una superficie, limpia, seca y lisa, normalmente se utiliza un cristal.
ii. Para revelar lo obtenido de la corrida electroforética, se puede realizar una cromatografía aplicando los colorantes adecuados.
iii. La electroforesis en papel puede separar sustancias de bajo peso molecular (aminoácidos y péptidos). La difusión que se observa en la cinta puede disminuirse incrementando la diferencia de potencial entre los electrodos, reduciendo el tiempo de la corrida electroforética (electroforesis de ALTO VOLTAJE), en este caso se puede utilizar el agente revelador (Ninhidrina) para situar las moléculas.
iv. Entre las opciones de las electroforesis en papel, tenemos las cintas de acetato de celulosa (homogéneas y transparentes), una vez separadas las moléculas, teñidas o reveladas (ambas), se pueden cuantificar mediante una densitometría.
Este tipo de electroforesis es muy utilizada en los laboratorios clínicos, debido a su fácil manipulación y su rápido desarrollo.
• Electroforesis en gel,
i. Los geles no son totalmente sólidos o líquidos.
i. Es una técnica de mayor resolución y provecho para la separación de macromoléculas.
ii. Los geles pueden ser de: poliacrilamida y agarosa, estos poseen poros de diferentes tamaños y dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de la migración de las moléculas durante el proceso electroforético.
iii. La separación no sólo ocurre por diferentes cargas de las moléculas, también por las diferencias de tamaños.
iv. Los geles están constituidos por un red enmarañada de polímeros y el líquido en el que se encuentra sumergido esta red, es un buffer iónico con las condiciones iónicas ideales de la corrida electroforética.
Existe variantes en la electroforesis en gel: electroforesis en una dimensión (continuo o discontinuo): PAGE-nativa, SDS-PAGE y el Isoelectroenfoque y en dos dimensiones (bidimensional)
• Electroforesis capilar,
i. Esta técnica sucede el interior de unos tubos capilares de aproximadamente 1 a 10 μm de diámetro.
ii. Los capilares pierden el calor fácilmente, admitiendo la aplicación de campos eléctricos elevados, y de manera se puede reducir los tiempos de separación.
Referencias Bibliográficas:
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2. Padilla P. Carmen A., Diez D. Jesús., Martínez G. Emilia, Bárcena R. José A y García A. Concepción (2004). Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico.Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.(17): 1-8.
3. García P. Hilda M (2000 ). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. Laboratorio Betera. UNIV DIAG (2):31-41
4. Yábar Varas, Carlos.(2003). Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN.Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 59 p. : 30 cm. — (Serie de Normas técnicas; 38)
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